内蒙古嘧啶胺针对不可逆的嘧啶类EGFR酪氨酸激酶抑制剂的EGFR突变和耐药

内蒙古嘧啶胺目的：包括WZ4002，CO-1686和AZD9291在内的针对特定突变类型，不可逆的第三代EGFR-TKI对于发生吉非替尼/厄洛替尼耐药突变T790M的肺癌患者及临床前模型中是有效的。但是，目前关于肿瘤对于这类EGFR酪氨酸激酶抑制剂的获得性耐药进展的研究很少。为此，我们尝试探寻研究和找出针对此类第三代EGFR-TKI的EGFR突变。

实验设计：我们进行了针对EGFR突变（单独敏感突变或伴随T790M突变）的Ba/F3细胞的亚硝基乙基脲（NEU）诱变筛选并选择出耐药的克隆。我们评估了EGFR-TKI在伴随耐药突变的EGFR突变模型中的敏感性。

结论：我们发现了3种主要的药物耐药突变，EGFR L718Q，L844V和C797S突变都导致对WZ4002和CO-1686的耐药。相比之下，只有C797S突变作用于AZD9291的耐药机制。产生L718突变，L844V突变或C797S突变同时伴随EGFR敏感突变（如19外显子缺失或L858R突变）的细胞对于一代EGFR-TKI吉非替尼和厄洛替尼仍然敏感。存在19缺失/L858R加上T790M以及C797S突变的情况下对目前所有EGFR-TKI耐药，但是L858R/T790M/C797S仍保留对Cetuximab的部分敏感。 

总结：我们的发现提供了针对第三代EGFR-TKI耐药机制的认识，并鉴定出对现有临床EGFR-TKI仍然有效的特定基因组合。这些研究也许会对未来EGFR-TKI治疗新策略的发展提供指导。

内蒙古嘧啶胺转化医学相关性：进行EGFR-TKI治疗后，常见的获得性耐药的发生机制是T790M突变的出现。目前对此的治疗策略包括嘧啶类针对特定突变的EGFR抑制剂，至今为止这些药物可以使大部分由于发生T790M突变导致耐药的肺癌患者肿瘤缩小。通过体外模拟药物耐药过程，我们发现导致针对化合物WZ4002以及临床化合物AZD9291和CO-1686发生相关耐药的EGFR突变。这些发现也许会帮助预测可能在临床中出现的获得性耐药机制，以及用于潜在的以后可以在临床中应用的治疗策略研究。

鉴定出新的药物耐药位点：为了找出可能导致对WZ4002产生耐药的突变位点, 我们使用了先前提到过的ENU诱导突变筛选法。将携带常见EGFR敏感突变（L858R and Del E746_A750）或伴随T790M突变的Ba/F3细胞，在进行100 nmol/L或1 mmol/L浓度的WZ4002中进行ENU处理2周后选择出耐药的克隆。在四中不同的细胞株中发现了三种突变：

L718Q (codon 2153, T>A), L844V (codon 2530, C>G), 和C797S (codon 2389, T>A) 

C797位点是和WZ4002共价结合的位点。若发生突变，则会导致药物耐药。L844V突变先前已经在一位非小细胞肺癌患者上被观察到。 位于L718位点的L718P，L718V和L718M突变先前已被发现，但是EGFR L718Q并未发现过。这些突变目前的临床意义还未明确。 我们接下来也验证了是否L718Q 和 L844V突变是致癌性的突变并且导致了耐药，抑或只是后者。T790M突变既是致癌突变同时又引起了对药物的耐药。 而EGFR L718Q 和 L844V 都不足以导致 IL3-独立细胞在EGFR野生型背景的生长（图1B）。有意思的是，虽然这些突变导致对WZ4002的耐药，但是他们对不可逆的喹唑啉基EGFR抑制剂阿法替尼、neratinib和CL-387、785仍然敏感（如图1C）。通过抑制EGFR磷酸化导致对这些Ba/F3细胞的生长抑制。吉非替尼作为一种可逆的喹唑啉基EGFR TKI，在L844V模型中有更好的疗效 （图1C）。但我们没能在Del E746_A750 Ba/F3细胞中使用ENU诱导筛选方法鉴定出二重突变(图1A)。处理过的EGFR Del E746_A750/L718Q而不是EGFR L858R/L718Q的Ba/F3细胞展示了一种生长劣势，从而解释了为什么这类突变没有在以前的方法中被发现（图1D）。内蒙古嘧啶胺在出现L718Q突变后，EGFR Del E746_A750细胞的EGFR磷酸化被抑制也支持了这个观点。